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Mit dem Schleppnetz erfolgreich: Forscher entdecken neue Cytomegalovirus-Rezeptoren.

September 2019 Text als pdf


Cora Stegmann, Jens von Einem und Christian Sinzger


Das humane Cytomegalovirus (HCMV) gehört zu den humanpathogenen Herpesviren und ist weltweit verbreitet mit einer Prävalenz zwischen 40 und über 90 Prozent. Wie alle Herpesviren verbleibt es nach der Erstinfektion lebenslang im Organismus und kann aus diesem Latenzzustand reaktiviert werden, sich erneut im Körper ausbreiten und über Körperflüssigkeiten ausgeschieden werden. In der Regel geschehen sowohl die Primärinfektion als auch die Reaktivierung unbemerkt ohne klinische Auffälligkeiten. Bei immunsupprimierten Personen oder bei Infektion des Fetus während einer Schwangerschaft können jedoch Krankheitssymptome in nahezu allen Organen auftreten, wobei insbesondere neuronale Entwicklungsstörungen beim Fetus und die Pneumonie bei immunsupprimierten Patienten klinisch relevant sind. Antiviral wirksame Hemmstoffe viraler Enzyme, die zur Vermehrung und Verpackung des viralen Genoms beitragen, sind zwar verfügbar, ihr Einsatz ist jedoch in einigen Fällen durch Nebenwirkungen oder die Entwicklung von Resistenzen eingeschränkt.
Es ist abzusehen, dass auf der Suche nach neuen antiviral wirksamen Substanzen auch Hemmstoffe des Viruseintritts (Entry-Inhibitoren) an Bedeutung gewinnen werden. Grundlage hierfür ist es, die molekularen Interaktionen bei Adsorption und Penetration zu kennen. Bei HCMV war seit langem vermutet worden, dass ein trimerer Hüllglykoprotein-Komplex (gH/gL/gO, Trimer) und ein pentamerer Hüllglykoprotein-Komplex (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131, Pentamer) beim Viruseintritt zelltypabhängig unterschiedliche zelluläre Rezeptoren benutzen [1,2]. Während der “platelet-derived growth factor receptor alpha” (PDGFRα) kürzlich als Interaktionspartner des Trimers auf Fibroblasten identifiziert und PDGFRα-Derivate als Entry-Inhibitoren von HCMV beschrieben wurden [3–5], war der Rezeptor des Pentamer-Komplexes auf Endo- und Epithelzellen weiter unbekannt.


Neuropilin-2 (NRP2) als Pentamer-Rezeptor auf Endothel- und Epithelzellen


Eine Arbeit aus dem Labor von Claudio Ciferri hat nun Neuropilin-2 als Interaktionspartner für den Pentamerkomplex identifiziert und gezeigt, dass diese Interaktion den Eintritt in Endo- und Epithelzellen vermittelt [6].
Die Forscher entwickelten zunächst eine Technologie-Plattform für die Entdeckung zellulärer Rezeptoren, indem sie die extrazelluläre Domäne von 1300 Typ 1-Transmembran-Proteinen mit dem Fc-Teil von humanem Immunglobulin G fusionierten und diese chimären Proteine einzeln auf Protein-A-beschichtete Mikrotiterplatten banden. Die Glykoprotein-Komplexe von HCMV wurden an COMP gebunden, ein oligomeres Knorpelmatrix-Protein, das wiederum mit ß-Lactamase als Indikator-Enzym verknüpft ist. Diese Sonden wurden auf die Mikrotiterplatten gegeben, und im Falle einer Interaktion konnte die Bindung nach Zugabe des Farbsubstrats Nitrocefin durch Colorimetrie nachgewiesen werden.
Mit diesem Verfahren konnten sie nicht nur PDGFRα als Rezeptor für den HCMV-Trimer wiederfinden, sondern auch NRP2 als neuen Kandidaten-Rezeptor für den HCMV-Pentamer identifizieren. Bio-Layer-Interferometrie bestätigte die Interaktion von NRP2 und Pentamer, die mittels Elektronenmikroskopie auch strukturell dargestellt wurde. In Infektionsversuchen konnte lösliches NRP2 die HCMV-Infektion inhibieren, NRP2-Überexpression die Infektion von Epithelzellen steigern, und die Reduktion des Rezeptors durch inhibitorische RNAs verminderte die HCMV-Infektion von Endothel- und Epithelzellen, was die Relevanz der Interaktion bei der Infektion dieser Zellen belegte.
Diese Arbeit ist nicht nur ein weiterer Schritt hin zur Entwicklung wirksamer Entry-Inhibitoren für HCMV, sondern sie zeigt auch exemplarisch eine innovative methodische Vorgehensweise für die Identifizierung bisher unbekannter Virusrezeptoren im Allgemeinen.


Der olfaktorische Rezeptor OR14|1 als Pentamer-Rezeptor auf Epithelzellen


Die Arbeitsgruppe von Timothy Kowalik suchte mittels eines CRISPR/Cas9 -basierten genom-weiten Screens noch umfassender nach zellulären Einflussfaktoren bei der Infektion von Epithelzellen, und identifizierte so OR14|1 als möglichen Entry-Rezeptor, der durch seine Interaktion mit dem Pentamer den Epithelzell-Tropismus von HCMV vermittelt [7]. Sie nutzen Zellen, die neben Cas9 auch eine RNA-Bibliothek mit jeweils 6 „single-guide RNAs“ (sgRNAs) gegen 19.050 menschliche Gene exprimierten. Die Zellen wurden über 3 Monate wiederholt mit HCMV infiziert, unter der Vorstellung, dass Zellen, in denen wichtige pro-virale Faktoren durch die entsprechende sgRNA ausgeschaltet waren, resistent gegen die Infektion wären und deshalb überleben würden. In den überlebenden Zellen wurden durch Sequenzanalyse über 300 verschiedene sgRNAs wiedergefunden, aus denen durch die Fokussierung auf Oberflächenproteine und durch den Vergleich von Fibroblasten und Epithelzellen schließlich OR14|1 als Kandidat ausgesucht wurde. Gezielte Knockdown-Experimente bestätigten, dass OR14|1 für die Infektion von Epithelzellen bedeutsam ist, und die Vorbehandlung von Viren mit den vier extrazellulären Peptiden aus OR14|1 zeigte für das N-terminale Peptid eine spezifische Hemmung der HCMV-Infektion von Epithelzellen. Aus der Tatsache, dass die Blockade der intrazellulären Signalwege von OR14|1 ebenfalls die Infektion hemmen konnten, schließen die Autoren dass HCMV OR14|1 nicht nur bindet sondern auch aktiviert, was möglicherweise die endozytotische Aufnahme des Virus stimulieren könnte.
Ciferri et al. konnten das Multipass-Transmembranprotein OR14|1 in ihrem Ansatz nicht finden, da dieser nur Typ-1-Membranproteine beinhaltete. Umgekehrt tauchte NRP2 im CRISPR/Cas9-Screen von Kowalik et al. zwar auf, war aber weniger stark repräsentiert und wurde deshalb nicht weiterverfolgt.


Zusammenfassung und Fazit


Beide Arbeitsgruppen verfolgten erfolgreich den Ansatz, durch geeignete innovative Laborverfahren den Beitrag zellulärer Faktoren zur HCMV-Infektion von Endothelzellen bzw. Epithelzellen umfassend zu untersuchen. Das zelluläre Oberflächenmolekül NRP2 wurde als Rezeptor für den pentameren Glykoproteinkomplex von HCMV auf Endothel- und Epithelzellen identifiziert, und das zelluläre Membranprotein OR14|1 als Pentamer-Rezeptor auf Epithelzellen.
Offen ist aktuell noch, ob diese beiden Rezeptoren redundante oder sequenzielle Rollen bei der HCMV Infektion von Epithelzellen spielen. Darüber hinaus ist zu klären, welchen Beitrag die beiden Rezeptorkandidaten auf anderen Zielzellen von HCMV leisten, deren Infektion über den Pentamer vermittelt wird. Besonders relevant sind in diesem Zusammenhang Granulozyten, Monozyten/Makrophagen und dendritische Zellen, denen eine Rolle bei der hämatogenen Verbreitung des Virus, bei Latenz und Reaktivierung und bei der Induktion der adaptiven Immunantwort zugeschrieben wird.
Wie bereits für den Fibroblastenrezeptor PDGFRα gezeigt [4], können lösliche Derivate von NRP2 und OR14|1 die HCMV-Infektion inhibieren und bergen somit ebenfalls Potenzial für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente.


Referenzen:


1.     Ryckman BJ, Chase MC, Johnson DC. HCMV gH/gL/UL128-131 interferes with virus entry into epithelial cells: evidence for cell type-specific receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(37):14118–14123.
2.     Vanarsdall AL, Chase MC, Johnson DC. Human cytomegalovirus glycoprotein gO complexes with gH/gL, promoting interference with viral entry into human fibroblasts but not entry into epithelial cells. J Virol. 2011; 85(22):11638–11645.
3.     Kabanova A, Marcandalli J, Zhou T, et al. Platelet-derived growth factor-α receptor is the cellular receptor for human cytomegalovirus gHgLgO trimer. Nat Microbiol. 2016; 1(8):16082.
4.     Stegmann C, Hochdorfer D, Lieber D, et al. A derivative of platelet-derived growth factor receptor alpha binds to the trimer of human cytomegalovirus and inhibits entry into fibroblasts and endothelial cells. PLoS Pathog. 2017; 13(4):e1006273.
5.     Wu Y, Prager A, Boos S, et al. Human cytomegalovirus glycoprotein complex gH/gL/gO uses PDGFR-α as a key for entry. PLoS Pathog. 2017; 13(4):e1006281.
6.     Martinez-Martin N, Marcandalli J, Huang CS, et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 2018; 174(5):1158-1171.e19.
7.     E X, Meraner P, Lu P, et al. OR14|1 is a receptor for the human cytomegalovirus pentameric complex and defines viral epithelial cell tropism. Proc Natl Acad Sci USA. 2019; 116(14):7043–7052.

Anschrift der Autoren:
Universitätsklinikum Ulm
Institut für Virologie
Cora Stegmann
cora.stegmann@posteo.de
Jens vn Einem
Jens.vonEinem@uniklinik-ulm.de
Christian Sinzger
Christian.Sinzger@uniklinik-ulm.de