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Visualisierung von CMV-Wirtszellinteraktionen auf Einzelzellebene

August 2019 Text als pdf

Dringt ein Virus in eine Wirtszelle ein, so entscheidet sich innerhalb weniger Stunden, ob das Virus oder die Zelle die Kontrolle übernimmt. Unterschiede (Heterogenitäten) zwischen den einzelnen Zellen beeinflussen ganz wesentlich diese Entscheidung. Mit bisherigen Methoden war eine Untersuchung der transkriptionellen Veränderungen, welche innerhalb der ersten Stunden der Infektion auftreten, technisch nur sehr begrenzt möglich. Die Mikroskopie oder Durchflusszytometrie können zwar einzelne Zellen vermessen, liefern dabei aber jeweils nur eine sehr limitierte Anzahl an Parametern. Demgegenüber vermag die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) das Transkriptom, und damit die transkriptionelle Aktivität von Tausenden von Genen, in Hunderten bis Zehntausenden einzelner Zellen zu bestimmen. So hat scRNA-seq in den letzten Jahren in viele Felder der biomedizinischen Forschung Einzug gehalten (1) und zu einem Paradigmenwechsel in der Analyse vieler biologischer System geführt (2). Das zentrale Problem von scRNA-seq hierbei war allerdings bisher, dass eine einzelne Zelle nur einmal, d.h. zu einem Zeitpunkt, analysiert werden konnte.

Eine Gruppe von Forscherinnen und Forschern aus Würzburg hat nun eine Methode entwickelt, zeitliche Abläufe auf Einzelzellebene mit scRNA-seq zu untersuchen (3). Ihre neue Methode, das scSLAM-seq (single-cell, thiol-(SH)-linked alkylation of RNA for metabolic labelling sequencing), basiert auf der RNA-Markierung mit 4-Thiouridin (4sU). Dieses wird für 1-2 Stunden zu Zellen gegeben und in Folge an Stelle von Uridin in neu synthetisierte RNA-Moleküle eingebaut. Im Zuge der anschließenden Einzelzell-RNA-Sequenzierung wird das eingebaute 4sU chemisch mittels Alkylierung in ein Cytosin-Analogon konvertiert, was in der Hochdurchsatzsequenzierung zu U-zu-C-Konversionen führt. Sequenzen (Reads), die solche Austausche enthalten, stammen also von RNA-Molekülen, die im Zeitintervall der 4sU-Markierung synthetisiert wurden. Sie können somit in silico von vorher schon existierenden RNA-Molekülen unterschieden werden. Mittels eines neuen bioinformatischen Algorithmus (GRAND-SLAM) konnten die Würzburger Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen zudem präzise bestimmen, wie viele Prozent der gesamten RNA eines Gens im jeweiligen Zeitintervall neu gebildet wurden, und welche RNA-Moleküle schon vorher da waren (4). Das statistische Verfahren liefert dabei nicht nur  einen entsprechenden Wert, sondern zudem für jede Zelle und jedes Gen ein entsprechendes Konfidenzintervall. Man erhält somit gleichzeitig Information darüber, in welchem Zustand (z. B. Zellzyklusstadium) sich die einzelne Zelle vor der Infektion befand, und wie sie auf die Infektion reagiert hat.

Herpesviren bringen mit ihren Viruspartikeln zahlreiche RNA-Moleküle aus der Mutterzelle in die Wirtszelle mit. Diese sogenannte „virion-associated RNA“ ist alt und enthält somit keine U-zu-C-Konversionen. Mittels scSLAM-seq und dem Analyseprogramm GRAND-SLAM kann damit für jede einzelne Zelle erstmals bestimmt werden, mit wie vielen Viruspartikeln sie infiziert wurde.

Mit ihrer neuen Methode untersuchte das Würzburger Team die transkriptionellen Veränderungen, die im Zuge einer Infektion von Bindegewebszellen mit dem murinen Zytomegalievirus (MCMV) innerhalb der ersten beiden Stunden nach Infektion auftreten. Dabei wurde 4sU gleichzeitig mit dem Virus zu den Zellen gegeben. Wie erwartet, etablierten die Zellen, die mit der höchsten Virusmenge infiziert wurden, am schnellsten und stärksten eine lytische Infektion. Zudem war die durch MCMV induzierte Interferon IFN- und NF-B Antwort (5, 6) in der „neuen“ (4sU-markierten) RNA bereits zwei Stunden nach Infektion klar zu erkennen. Dadurch ließen sich auch klar die nicht-infizierten von den infizierten Zellen unterscheiden. Wenn hingegen, wie bisher üblich, die gesamte zelluläre RNA (und nicht nur die in den zwei Stunden neu synthetisierte RNA) als Maßstab genommen wurde, war diese Unterscheidung nicht möglich. Das scSLAM-seq ermöglicht daher eine deutlich sensitivere Untersuchung.

Interessanterweise zeigten die mit der höchsten Virusmenge infizierten Zellen auch die stärksten IFN-Antworten. Die autokrine IFN-Signaltransduktion dominiert daher offensichtlich die IFN Antwort in den ersten beiden Stunden nach Infektion. Wie schon in früheren Studien beschrieben, infiziert MCMV Zellen am effizientesten in der G1-Phase des Zellzyklus (7, 8). Basierend auf dem Zellzyklusstadium der einzelnen Zellen und der Infektionsdosis konnten in der aktuellen Studie erstmals Dosis-Wirkungsanalysen durchgeführt werden. Die Anzahl eintretender Viruspartikeln und das Zellzyklusstadium erklären zusammen 59% Prozent der Varianz in der viralen Genexpression. Mittels Korrelationsanalysen lassen sich jetzt Gene identifizieren, die mit einer guten bzw. schlechten Virusreplikation korrelieren. Die neue Methode erlaubt somit die Heterogenität von Zellen auszunutzen, um neue zelluläre Restriktionsfaktoren bzw. provirale Gene und Signalwege zu identifizieren.

Die Transkription zellulärer Gene geschieht nicht gleichmäßig, sondern schubweise, mit zum Teil langen Pausen (9). Mit dem Verhältnis von „neuer“ zu "alter" RNA konnten die Forscherinnen und Forscher eine Metrik beschreiben,  inwieweit ein Gen gleichmäßig oder schubweise transkribiert wird. So wird beispielsweise die für das ribosomale Protein Rpl18a kodierende mRNA kontinuierlich und gleichmäßig transkribiert. Bei dem eIF4E2-Gen hingegen, das für ein Protein kodiert, das die Translation steuert, erfolgt die Transkription schubweise. Das bedeutet, dass in einem Teil der Zellen im untersuchten Zeitraum kein eIF4E2 transkribiert wurde, in anderen Zellen aber sehr viel. Es stellte sich heraus, dass derartige Unterschiede von den Promotoren der jeweiligen Gene bestimmt werden. So zeigen Gene mit korrekt positionierter TATA-Box gewöhnlich eine kontinuierliche, gleichmäßige Transkription. Dagegen ist eine schubweise Transkription mit CpG-reichen Genpromotoren assoziiert, deren Methylierung die Initiation der Transkription negativ beeinflusst. Die Autorinnen und Autoren konnten somit zeigen, dass die bekannte, ausgeprägte Heterogenität von Genexpression in eigentlich uniformen Zellpopulationen durch Promotor-bestimmte Unterschiede im Transkriptionsverhalten der einzelnen Gene entsteht. Heterogenität in den RNA-Profilen einzelner Zellen sind somit eine Folge der schubweisen Aktivität eines Teils der Genpromotoren im humanen Erbgut, und nicht ein zell-spezifisches Phänomen.

Im Zuge einer IFN-Antwort werden hunderte zellulärer Gene induziert. Bei der Analyse von größeren Zellpopulationen ließ sich bisher nicht unterscheiden, ob die verstärkte Expression dieser Gene durch eine erhöhte Transkriptionsrate in allen Zellen erfolgt oder durch die Anschaltung dieser Gene in Zellen, die diese Gene bisher gar nicht exprimierten. Mittels scSLAM-seq zeigte sich jetzt, dass die MCMV-induzierte IFN- und NF-B Antworten innerhalb der ersten beiden Stunden überwiegend auf  einem Anschalten (Off-On) von Transkription beruht. Nach Infektion transkribieren in der Regel einfach mehr Zellen die entsprechenden Gene. Die durchschnittlichen absoluten Transkriptionsraten pro Zelle, die das entsprechende Gen transkribiert, bleiben allerdings unverändert im Vergleich zum Zustand vor der Infektion. Dies erlaubt es Zellen, einen antiviralen  Zustand zu etablieren ohne das Risiko von Überreaktionen, die zu Autoimmunphänomenen und –erkrankungen führen könnten, zu erhöhen.

Zusammengefasst haben die Autorinnen und Autoren dieser Studie eine wichtige Methode für die immer bedeutender werdende Einzelzell-RNA-Sequenzierung etabliert. Zudem zeigen sie, wie die Einzelzellsequenzierung neue Einsichten in die Virus-Wirtszell-Interaktionen liefert und wie virologische Forschung andere Felder wie hier beispielsweise die Regulation der Transkription voranbringen kann.

Referenzen
(1) A. Tanay and A. Regev. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature (2017)
(2) Y. Wang and N. E. Navin. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies. Mol Cell (2015)
(3) F. Erhard, M. A. P. Baptista, T. Krammer, T. Hennig, M. Lange, P. Arampatzi, Ch. S. Jürges, F. J. Theis, A.-E. Saliba, L. Dölken. scSLAM-seq reveals core features of transcription dynamics in single cells. Nature (2019)
(4) C. Jürges, L. Dölken, F. Ehrhard. Dissecting newly transcribed and old RNA using GRAND-SLAM. Bioinformatics (2018)
(5) L. Marcinowski, M. Lidschreiber, L. Windhager, M. Rieder, J. B. Bosse, B. Rädle, Th. Bonfert, I. Györy, M. de Graaf, O. Prazeres da Costa, P. Rosenstiel, C. C. Friedel, R. Zimmer, Z. Ruzsics, L. Dölken. Real-time transcriptional profiling of cellular and viral gene expression during lytic cytomegalovirus infection. PLoS Pathog (2012).
(6) E. Krause, M. deGraaf, P. M. Fliss, L. Dölken, W. Brune. Murine cytomegalovirus virion-associated protein M45 mediates rapid NF-κB activation after infection. J Virol (2014).
(7) D. H. Spector. Human cytomegalovirus riding the cell cycle. Med Microbiol Immunol (2015)
(8) H. Weisbach, C. Schablowsky, B. Vetter, I. Gruska, C. Hagemeier, L. Wiebusch. Synthetic lethal mutations in the cyclin A interface of human cytomegalovirus.
PLoS Pathog (2017)
(9) K. Tantale,  F. Mueller, A. Kozulic-Pirher, A. Lesne, J.-M. Victor, M.-C. Robert, S. Capozi, R. Chouaib, V. Bäcker, J. Mateos-Langerak, X. Darzacq, Ch. Zimmer, E. Basyuk, E. Bertrand. A single-molecule view of transcription reveals convoys of RNA polymerases and multi-scale bursting. Nat Commun (2016).

Autor:
Dr. Emanuel Wyler
Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Berlin
Institute for Medical Systems Biology
Emanuel.Wyler@mdc-berlin.de